可用以進行藥物開發之皮膚脫色或發炎疾病的斑馬魚模式

色素細胞產生黑色素(melanin)之活性與膚色有關,同時也與皮膚紫外線的抵抗力與皮膚癌風險有關。黑色素,是由皮膚基底層的色素細胞中的黑素體(melanosome),經由酪胺酸酶(tyrosinase)之催化所產生。後天造成的色素脫失症(hypopigmentation)如白斑(vitiligo),是一種黑色素細胞(melanocyte)死亡的疾病,常伴隨有例如:巨噬細胞等免疫細胞的浸潤,在皮膚外觀上會有不規則白色的斑點、斑塊、灰髮,甚至有視網膜色素上皮層色素(retinal pigment epithelium, RPE)脫色、退化與視力受損等症狀發生。白斑的全球盛行率約為0.5 – 2%,其致病機制尚不清楚,因此無法提供有效的治療與預防,白斑並不危及性命,但由於影響外觀,可能對患者的心理造成負面影響。本院分子與基因醫學研究所江運金副研究員及其團隊成員許家豪博士後研究員,與中央研究院劉淦光博士合作,實驗證明nicastrinhi1384突變斑馬魚是一個極具潛力的脫色疾病模式,可應用於皮膚相關疾病的治療、開發脫色疾病或發炎藥物之研發。此論文已發表於國際知名皮膚研究期刊Journal of Investigative Dermatology(2020; 140:404-414)。

有關白斑的致病機制,已有一些相關研究發表:在基因組關聯性分析(GWAS)研究結果顯示,TYR以及幾個與自體免疫疾病相關的基因,例如:IL2RAMHC均與白斑有關,在皮膚脫色發炎的位置,也可觀察到巨噬細胞。γ-secretase是由Presenilin、Pen2、Nicastrin所組成的複合蛋白,過去以γ-secretase 抑制劑進行白斑之人體臨床試驗,以及在實驗動物上,確實可改變毛色。有研究發現,缺失nicastrin會降低γ-secretase的穩定性,為深入探討其相關性,江運金副研究員利用nicastrinhi1384突變斑馬魚模式進行白斑的致病機制研究。研究團隊觀察到在nicastrinhi1384突變斑馬魚品系中,其子代在受精後(hours postfertilization, hpf)48小時,四分之一有色素脫失症,76 hpf則有八分之一呈現捲尾性狀(curled-up tail),這些突變所表現的漸進性色素脫失症可以很容易的在眼睛與表皮區域觀察到,並證明黑色素在nicastrinhi1384突變株的脫色現象是黑色素細胞死亡,並非基因表現之問題。

研究團隊以穿透式電子顯微鏡觀察nicastrinhi1384突變斑馬魚,量化因視網膜色素上皮層色素脫色所造成的黑素體變化情形。結果顯示,相較於野生種斑馬魚,nicastrinhi1384突變種的黑素體在受精3天後(3 days postfertilization, 3dpf)呈現多空泡的胞內體(multivesicular endosomes),其色素量亦少於野生種,顯示黑素體為未成熟狀態。nicastrinhi1384同型核子的粒線體(mitochondria),則呈現腫脹,其黑色素細胞呈現非細胞凋亡型的細胞壞死。過去的文獻曾提出,tyrosinase下游的代謝產物,例如:純黑色素(eumelanin),與黑色素細胞之壞死有關,研究團隊以tyrosinase抑制物-苯硫脲(phenylthiourea, PTU)抑制nicastrinhi1384突變斑馬魚tyrosinase之活性,在22 hpf一開始即施以PTU,所有子代在3 dpf皆可清楚觀察到表現dct基因黑色素細胞(dct-expression cell),而未施以PTU的nicastrinhi1384突變斑馬魚,則有四分之一的子代微量或幾乎不表現黑色素細胞標誌dct基因。接著在48 hpf再以PTU處理,雖已發生脫色,但顯示可以降低破壞黑色素細胞,並防止視網膜色素上皮層色素的脫色;同時,粒線體的腫脹以及黑色素細胞壞死的比例亦明顯降低。

此外,過去文獻提出nicastrin對γ-secretase作用在其基質之一的Notch並非必需,研究團隊以γ-secretase抑制劑N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-Lalanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) 處理野生種斑馬魚4體節(somite stage)的胚胎,呈現不成熟的黑色素細胞與腫脹的粒線體,亦觀察到含有破碎黑素體的壞死黑色素體與粒線體皺褶減少;對野生種幼魚施以DAPT可觀察到脫色;對48 hpf的胚胎施以DAPT與PTU,可防止脫色(圖1)。以DAPT處理nicastrinhi1384突變斑馬魚,則會強化脫色。這些實驗結果顯示,nicastrinhi1384突變斑馬魚tyrosinase依賴性的脫色,是因為γ-secretase活性的降低。此外,過去的研究指出,白斑病的黑色素細胞壞死與粒線體壓力,會驅動斑馬魚的先天性免疫反應,並接續產生後天免疫的分子機制。研究團隊進一步測試nicastrinhi1384突變斑馬魚之先天免疫系統是否處於活化狀態,透過植入具有報導功能的巨噬細胞(macrophage reporter line, Tg(mpeg1:mCherrygl23)發現,巨噬細胞會在黑色素細胞所在之處,並吞噬黑色素細胞,而且,已經受損的黑色素細胞會被鄰近的黑色素細胞所吞噬,顯示在nicastrinhi1384突變斑馬魚模式下,黑色素細胞損傷會活化先天性免疫反應。

圖1(a)以DAPT或DAPT+PTU處理的時間;(b)當以DAPT處理,野生種幼魚呈現黑色素細胞不成熟(藍色箭頭),粒線體皺褶減少(綠色箭頭);(c)以DAPT處理野生種斑馬魚,有脫色現象;但同時以DAPT+PTU處理,則還原脫色;(d)粒線體與細胞核的定量統計

綜合上述,研究團隊發表了nicastrin在白斑機制上的嶄新功能。當明顯降低nicastrin之基因轉錄,影響黑素體之成熟,造成tyrosinase依賴性粒線體腫脹與黑色素細胞死亡,nicastrinhi1384突變斑馬魚模式證實,皮膚脫色的表現是因為γ-secretase失去活性的結果。此外,穿透式顯微鏡影像結果顯示,巨噬細胞會召集以吞噬黑色素細胞碎片,詳見圖2示意圖。此研究提出nicastrinhi1384突變是一個有潛力的斑馬魚脫色疾病模式,可用於皮膚相關疾病的治療、開發脫色疾病或發炎之藥物。


圖2:nicastrin在白斑機制之示意圖。Nicastrin為γ-secretase的成員之一,維持黑素體所必需的蛋白,nicastrin減少會損害γ-secretase的功能,接續干擾黑素體的發育。之後,黑素體缺陷導致釋放出黑素體毒性物質,例如:eumelanin及其前驅物會傷害胞器,例如:粒線體。此嚴重的傷害觸發黑色素細胞的壞死和導致DAMP(damage-associated molecular pattern)的釋放,隨後會召集例如:巨噬細胞(吞噬細胞),吞噬受損的黑素細胞並呈現抗原

文/圖:分子與基因醫學研究所許家豪博士後研究員、江運金副研究員

 

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