是不是HeLa有關係—您所使用的細胞株正確嗎?

動物細胞應用於生命科學研究領域中,其發展歷史已超過一百年。細胞培養技術也為人類醫學疾病研究與生物技術產業發展,奠定相當重要的基礎。然而需要注意的是,近年來有多篇報告指出,目前研究人員廣為使用的動物細胞株,存在交叉污染(cross-contamination)或是誤認(misidentified)的情形。尤其是自國外引進或是來自私人實驗室分讓的細胞株,若沒有經過特定的檢查程序確認細胞株是否正確,就有極高的機率存在著交叉污染或是細胞株誤用的問題。報告指出,有相當高比例的細胞株是在建立培養的過程中,受到HeLa細胞的交叉污染。有別於常見的微生物污染,當實驗室使用已證明為錯誤的細胞株、或是操作過程中發生不同細胞間的交叉污染,甚至是錯誤標示(mislabeling)而產生混淆時,研究人員往往無法即時地發現與改正,進而誤導研究人員對於實驗結果的認知,並影響研究成果解讀的正確性。

根據1999年德國微生物及細胞培養收集中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, DSMZ)發表於International Journal of Cancer的報告指出,DSMZ有18%的人類細胞株受到其他人類細胞的交叉污染。美國菌種保存中心(American Type Culture Collection, ATCC)在經過測試後也發現,在其所收藏的細胞株中,有31株動物細胞株存有不正確或是細胞株交叉污染的問題 (https://www.atcc.org/Products/ Cells and Microorganisms/Cell Lines/ Misidentified Cell Lines.aspx)。國際細胞株鑑定委員會(International Cell Line Authentication Committee, ICLAC)致力於收集並公布錯誤細胞株之相關資訊,經分析後確認,目前有451株錯誤細胞株已下架不再公開提供,但仍有31株錯誤細胞可由細胞庫或實驗室來源取得,因此研究人員使用細胞株時不可不慎(相關資料請查閱:https://iclac.org/news/version-10-of-the-iclac-register-released/)。

重視細胞誤用/交叉污染的問題
錯誤的細胞株通常發生在一開始建立時,即錯誤標示了細胞的名稱或組織來源。而常見發生於細胞株交叉污染的HeLa細胞,因具有生長快速且可長期繼代增殖的能力,若在培養過程中操作不慎,也可能會經由不當的共用培養基或藉由氣溶膠(aerosol)傳播至其他細胞的培養皿,不久後即取而代之;除了HeLa細胞外,其他生長快速的細胞亦可能造成細胞的交叉污染。此外,也有初代培養時標示為人類組織來源的細胞,在細胞株建立的階段,就已經被實驗室既有的小鼠細胞所取代,而造成錯誤。經過統計,目前有超過三萬三千篇的科學論文,是使用錯誤的細胞株所發表的成果,而這些使用錯誤細胞所衍生的無效研究數據,不僅造成研究經費與資源的浪費,對於研究人員長期投注的心力,更造成莫大的損失。為了導正並提醒研究人員重視細胞誤用或是交叉污染的問題,現在已有許多國際知名期刊要求作者提供論文所使用之細胞株的複核資料,作為論文送審的先決條件。美國國家衛生研究院(NIH)自2016年起,也開始要求研究人員在向NIH提出計畫申請時,在研究期間必須針對使用的關鍵生物材料定期進行複核,以確保研究成果之有效性與可再現性。

常用細胞株之鑑定/複核技術介紹
細胞株的正確性可以透過檢驗加以鑑定。目前常用於細胞株之鑑定/複核技術包括:同功酵素分析技術(isozyme analysis)、染色體核型分析(chromosome karyotyping)、DNA指紋分析(DNA fingerprinting)與短序列重覆片段聚合酶連鎖反應(short tandem repeat polymerase chain reaction, STR-PCR)等。其中,STR-PCR因具有高準確性(accuracy)、可靠性(reliability)、耐用性(robustness)、低成本和快速之特性,是目前應用於人類細胞株複核鑑定的主要技術。ATCC標準發展組織也建立了STR-PCR分析的標準化規範,且已成為美國國家標準ANSI/ATCC ASN-0002-2011。

國家衛生研究院(簡稱國衛院)與食品工業發展研究所(簡稱食品所)生物資源保存及研究中心(簡稱食品所BCRC)合作,自2009年起開始推廣STR-PCR細胞複核鑑定服務,同時在許多研習活動當中積極向研究人員宣導細胞株複核在科學研究領域的重要性,期能建立使用正確細胞株的重要觀念。國際期刊International Journal of Cancer的官方網站上,公開認可食品所BCRC為國際上具有提供細胞株身分鑑定能力的機構,顯示食品所BCRC人類細胞株複核服務之公信力。

研究人員要避免使用錯誤細胞株或是有交叉污染問題的細胞,可以透過下列方式達成:

  • 開始進行細胞培養實驗前,即先透過公開資訊搜尋(https://iclac.org/databases/),確認欲使用的細胞株沒有交叉污染或是誤用的歷史,例如:Chang Liver細胞株已證實為HeLa細胞,即使可以取得也不宜使用。
  • 盡量透過大型公開、具有品質管制公信力之細胞庫取得細胞株。
  • 落實實驗室細胞株品質管制措施,避免細胞株交叉污染,包括:
    1. 培養基不混用;
    2. 同一時間於生物安全櫃(biosafety cabinet)內只處理一種細胞株;
    3. 不同株細胞間的操作時間至少間隔15分鐘;
    4. 使用後澈底清潔生物安全櫃內的操作環境。
  • 定期檢測是否有其他細胞株之污染,或是透過細胞複核鑑定服務,複核所使用細胞株的正確性。


圖:落實實驗室細胞株品質管制措施與優良操作,可避免細胞株交叉污染

國家衛生研究院細胞庫
國衛院自1998年起與食品所合作,建置「國家衛生研究院細胞庫」核心設施,提供研究人員正確且沒有微生物污染的細胞株,目前可對外公開提供超過六百株細胞。所有可提供之細胞株,皆經過食品所BCRC嚴格品管檢測,包括無菌試驗(細菌與黴菌污染檢測)、黴漿菌污染檢測(直接培養法與指示細胞法),以及人類細胞複核(STR profile)等,確認細胞株沒有微生物污染以及細胞株之正確性後,方對外提供。食品所BCRC亦提供相關之細胞產品品管檢測服務,且所有檢測服務項目,皆符合ISO 9001:2015或TAF/ISO 17025:2017之標準,是幫助研究人員進行細胞株品管和人類細胞株鑑定的優良資源。未來國衛院將持續與食品所合作,透過細胞庫計畫收集由國人自行開發建立的細胞株,並嚴格執行相關的品管檢測,確保細胞品質,提供研究人員豐富且高品質的細胞資源。細胞庫相關資訊與服務項目,請參見國家衛生研究院細胞庫http://w3.nhri.org.tw/cellbank/。細胞株之購買、寄存與相關檢測服務項目,請參見食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心網頁https://www.bcrc.firdi.org.tw/

 參考文獻

  1. Horbach SPJM, Halffman W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 2017;12(10):e0186281.
  2. Hughes P, Marshall D, Reid Y, Parkes H, Gelber C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need? Biotechniques. 2007;43(5):575-86.
  3. MacLeod RA, Dirks WG, Matsuo Y, Kaufmann M, Milch H, Drexler HG. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int J Cancer. 1999;83(4):555-63.

文/圖:食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心、國家衛生研究院細胞庫核心設施計畫主持人許瓈文研究員

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