原發性肝細胞癌小鼠模式之免疫療法研究

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)高居癌症致死率第2位,目前肝癌的治療仍以手術治療、酒精局部注射、電燒及肝動脈化學藥物栓塞治療(TACE)為主。肝腫瘤治療後復發率極高,且對標靶藥物與化學藥物的反應不佳;因此對肝癌免疫療法寄予重望,因學界極需能觀察HCC腫瘤微環境及可能用於評估免疫治療效果的臨床前動物模式。

目前實驗室常用之肝細胞癌小鼠模式包含化學誘發、同種(syngeneic)及異種(xenograft)移植(implantation)肝癌細胞株、基因轉殖模式(genetically engineered models, GEM)。化學誘發以及基因轉殖需要長時間才能誘發腫瘤,異種移植模式則只能施打於免疫缺鼠,而同種移植之腫瘤微環境與原發性肝腫瘤之原始成因皆不盡相同。高壓注射法(hydrodynamic injection)可直接將裸露質體(plasmid)DNA送入肝組織表達相關蛋白質,過去廣泛應用於肝臟病毒感染或肝癌之研究。高壓注射法可將轉殖基因直接送入各品系小鼠肝臟,無需透過繁殖或製造基因轉殖鼠,可降低研究成本及時間。先前德國Greifswald大學Calvisi教授實驗室建立以跳躍子(transposon)攜帶致癌基因,並以高壓注射法殖入致癌基因建立不同的肝癌小鼠模式,可對致癌基因進行研究。以跳躍子系統將致癌基因AKT、N-Ras帶入肝細胞,可在FVB/N小鼠快速長出腫瘤,雖然Ras突變很少在肝腫瘤中發現,但同時活化Akt/mTOR與Ras/MAPK路徑之下,在人類肝腫瘤很常見。過去的研究指出,當單獨活化AKT,需約三十週以誘發肝腫瘤形成;而單獨活化RAS時,則無法誘發肝腫瘤形成,但會造成免疫缺陷鼠肝細胞衰老。此外,Akt/mTOR路徑所誘發之脂肪生成(lipogenesis),對肝腫瘤的進展(progression)具關鍵角色。

本院分子與基因醫學研究所黃麗蓉助研究員團隊利用上述高壓注射法與跳躍子技術,以sleeping beauty transposon system,將致癌基因Akt及N-Ras送入免疫健全小鼠肝臟細胞內誘發肝細胞癌,藉由此技術所誘發之肝腫瘤可表現冷光及腫瘤抗原,因此可以非侵入性的方式觀察腫瘤的生長及偵測具腫瘤抗原特異性之T細胞反應(用於誘導此肝細胞癌之質體示意圖及操作程序詳見圖1)。此原發性肝細胞癌小鼠模式之腫瘤,形成速度較化學誘發與基因轉殖小鼠之腫瘤生成更快,腫瘤之型態則有瀰漫性(diffuse)及結節性(nodular)。研究團隊將Akt1、N-RasV12 致癌基因以及sleeping beauty transposase的質體,經尾靜脈高壓注射進入免疫健全小鼠之肝細胞。在注射後45天內,所有小鼠肝臟均觀察到針尖狀白點,並在75天後,皆產生肝腫瘤結節。肝臟病理切片結果顯示,高壓注射30天後,大部分的肝組織仍顯正常,只除了部分肝臟組織發生脂肪變性之病灶。分別在45天與58天,各有80%和100%的小鼠肝臟組織均檢出癌變,在腫瘤區域可觀察到細胞質呈嗜鹼性(cytoplasmic basophilia)以及高核質比(nuclear-to-cytoplasmic ratio),也可觀察到脂肪變性與腫大的肝癌細胞。此外,腫瘤組織內有單核細胞的浸潤,且間質細胞增加,特別是在腫瘤結節與正常組織交界處。這些結果顯示,此小鼠模式可在2個月內誘導免疫健全小鼠產生原發性肝腫瘤。

研究團隊當以高壓注射法打入帶有表現冷光的質體pKT2/CLP-AKT-OVA-HBc-HBs-LUC、 pT/Caggs-NRASV12與pCMV(CAT)T7- SB100到小鼠肝臟,再以非侵入IVIS imaging system觀察發現,在注射後的第1週到第5週之間冷光數值下降,可能是由於免疫反應將接受到質體的肝細胞清除;而在第5週到第7週間冷光數值開始增加,反應出腫瘤的持續生長。另觀察到有三分之一的小鼠,在注射後第3週時並未有冷光數值下降的現象,而呈現持續上升。之後解剖發現,這些小鼠的腫瘤型態為瀰漫性。而其他冷光數值上升較慢之小鼠(slow progression)則發展出結節性肝腫瘤的重量,腫瘤結節之重量與冷光數值成正比。 在瀰漫性腫瘤脂肪聚積之腫瘤組織中,有較多正在分裂之腫瘤細胞(Ki-67+),而巨噬細胞(macrophage)、骨髓衍生抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)與活化的肌纖維母細胞(myofibroblasts)亦在瀰漫性浸潤腫瘤組織中。另亦可觀察到CD31+細胞,但以結節性腫瘤中較多;二種型態腫瘤組織中均可發現CD4+、 CD8+T細胞以及CD19+ B細胞。在結節性腫瘤組織中,淋巴球較集中分布於腫瘤基質內,而在瀰漫性肝腫瘤組織則較為分散。(研究結果詳見圖2)。

原發肝腫瘤小鼠模式適用於研發肝癌之T細胞治療、免疫檢查點抑制劑或其他合併療法
CD8+ T細胞對抑制腫瘤生長與防止腫瘤復發極為重要,研究團隊進一步分析CD8+T細胞反應在此原發性肝腫瘤的特徵,並評估此小鼠模式是否適用於肝腫瘤藥物之篩選與免疫治療之開發。在以高壓注射法投入AKT-OVA-HBc-HBs-LUC, NRASV12與transposase質體後,在小鼠腫瘤組織可分離出具HBs-190-197-、HBc93-100-、OVA257-264-專一性之CD8+ T細胞,然而這些具腫瘤。專一性的CD8+ T細胞無法控制腫瘤生長。與脾臟的CD8+ T細胞相較,這些肝腫瘤的CD8+ T細胞表面,表現大量的免疫檢查點(immune checkpoints)如PD-1、LAG-3、2B4與TIGIT,。推測是腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)造成T細胞的耗竭(exhaustion)。這些結果顯示,此殺功能,進而性之T細胞無法抑制腫瘤之生長。肝腫瘤之腫瘤微環境具免疫抑制性,使腫瘤微環境中之 T細胞無法施行細胞毒殺功能,因而無法抑制腫瘤之生長。研究團隊進一步將體外培養之具腫瘤專一性之CD8+ T細胞靜脈注射植入帶有肝腫瘤之小鼠,施打前的CD8+ T細胞幾乎不表現PD-1或TIGIT,當這些細胞進入腫瘤微環境後,多數受困於腫瘤基質中且高度表現PD-1及TIGIT。由於腫瘤基質中的細胞表現高量PD-L1及PD-L2,因此在施打T細胞時,同時施打anti-PD-1抗體以阻斷T細胞之PD-1訊息傳遞,試圖拯救腫瘤內之T細胞耗竭,然而anti-PD-1卻無法拯救T細胞控制腫瘤之進展(研究結果詳見圖3)。此結果也呼應了近期Merck藥廠之anti-PD-1抗體藥物(Keytruda)無法有效延長肝癌末期患者之存活時間,或抑制腫瘤生長之臨床試驗結果。

骨髓細胞,包含腫瘤內巨噬細胞(tumor-associated macrophages, TAM)與骨髓抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs),具促進腫瘤生長或免疫抑制之特性。此原發肝腫瘤模式之肝腫瘤組織中,巨噬細胞和骨髓抑制細胞的數量較控制組小鼠肝臟多。自腫瘤取出之巨噬細胞與骨髓抑制細胞對T細胞之增殖有強烈的抑制效果。此外,在腫瘤微環境中也偵測到較高量調節T細胞(regulatory T cells, Treg),這類細胞可能參與了免疫抑制作用。另外,比較幾種T細胞在腫瘤與脾臟數量上的差異,Treg及CD4+ T細胞的比例是類似的,但CD8+對CD4+ T細胞的比例,在肝腫瘤的比例則顯著較高,顯示肝腫瘤微環境會吸引但抑制CD8+ T細胞反應,因而確保腫瘤之生長。

此原發性肝細胞癌小鼠模式誘發形成之腫瘤表現冷光及腫瘤抗原,可用於研究具腫瘤特異性之T細胞反應及肝癌細胞與免疫抑制細胞群之交互作用。同時,極適合用於研發肝癌免疫療法與細胞治療之臨床前動物模式,也可應用於評估小分子藥物治療肝癌之效力。這項肝腫瘤小鼠模式技術以及相關的研究成果已發表於Journal for ImmunoTherapy of Cancer (Yu-Tsu Liu, et al., J Immunother Cancer. 20186:144)。本院已著手進行將本項動物模式技術轉移予國家級動物供應單位或臨床前動物試驗服務承包廠商,以因應各界肝癌研究之動物模式需求。

文/圖:分子與基因醫學研究所劉又慈研究助理、黄麗蓉助研究員

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