mprF點突變對MRSA臨床菌株達托黴素、萬古黴素和扼煞西林敏感性的影響
Effect of a point mutation in mprF on susceptibility to daptomycin, vancomycin, and oxacillin in an MRSA clinical strain

在革蘭氏陽性菌中,以抗甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌(MRSA)最受重視,這種菌除了是醫院中的常見致病菌,也是社區感染的主要病菌。MRSA對市面上大多數的乙內醯胺(β-lactam)類抗生素皆具有抗藥性,台灣MRSA占不同患者群分離出的金黃色葡萄球菌中高達50至70%。治療嚴重MRSA感染的主要選擇為萬古黴素(vancomycin);然而,近來MRSA對萬古黴素的敏感性在降低,其中以hVISA(heterogeneous vancomycin intermediate S. aureus)最難偵測出。hVISA具有不同程度的抗藥性次族群細胞,而表現出對萬古黴素混合的抗敏性,導致患者萬古黴素治療的失敗。近年來因萬古黴素治療失敗個案的增加,達托黴素(daptomycin)的使用也逐漸增加。達托黴素雖為較新抗MRSA藥物,然而達托黴素治療失敗的個案也已發生,雖然達托黴素與萬古黴素作用機制有顯著差異,但對達托黴素具抗藥性的菌大多對萬古黴素亦具低程度混合抗敏性,而hVISA亦有對達托黴素感受性降低的趨勢。相反的,此類MRSA常見到對乙內醯胺抗生素感受性增加,此現象稱之為翹翹板效應(seesaw effect),但導致此現象的基因基礎尚未清楚。

萬古黴素與乙內醯胺抗生素的作用目標皆為細胞壁,但作用機制不同;萬古黴素是與合成細菌細胞壁的前驅物質D-alanyl-D-alanine結合,進而抑制醣肽聚合,造成細菌細胞壁無法合成。而各種乙內醯胺類抗生素的作用機制則均相似,都能抑制細胞壁肽聚醣合成酶,即青黴素結合蛋白(penicillin binding proteins, PBPs),從而阻礙細胞壁肽聚醣合成。達托黴素其作用為改變細菌細胞膜導致去極化(depolarization)而造成細菌死亡。找出這三類不同抗生素的共通機制,也許可延長現有抗生素使用壽命及找出新抑制標的。金黃色葡萄球菌對這三類抗生素產生抗藥性分別是增厚細胞壁以抗萬古黴素、增加細胞膜外正電荷以抗達托黴素、獲得mecA基因編碼出青黴素結合蛋白(Penicillin-binding protein 2a, PBP2a)成為MRSA,為金黃色葡萄球菌得到抗甲氧苯青黴素的能力,此蛋白可合成細胞壁且與乙內醯胺類抗生素的親合性低,故對這類型的抗生素有抗藥性。

本院感染症與疫苗研究所陳逢叡副研究員與楊采菱研究員,以及高雄長庚醫院李禎祥醫師所組成的研究團隊先前於同一位患者身上分離出一系列MRSA菌株共8株(CGK1~8);由於患者有接受新型抗生素達托黴素治療,因此研究團隊格外注意此治療失敗的個案其分離出的菌株所發生的變化。這一系列菌株自CGK6到CGK8皆已對達托黴素降低感受性,但增加對乙內醯胺類抗生素扼煞西林(oxacillin)的敏感性,其中只有CGK7成為hVISA。經基因比對分析發現,CGK6到CGK8皆含有一個相同的胺基酸突變L431F發生在MprF蛋白上,MprF蛋白原為細菌用來對抗宿主的陽離子抗菌胜肽的膜蛋白。為了驗證此單一胺基酸突變在原始菌株的影響,研究團隊採用了在染色體上置換單一核苷酸方法,將CGK5的MprF其第431位置由L置換成F,此方法讓研究團隊得以檢視它在CGK5所造成的影響。研究結果顯示,MprF蛋白的L431F突變能導致細胞膜外的正電增加,降低與帶正電的達托黴素結合而產生抗藥性;此外,此突變能使vraSR過度表現並透過vraSR的啟動子調控,導致細胞壁合成相關基因增加表現而造成細胞壁變厚及生長緩慢,因而對萬古黴素產生抗藥性。

研究團隊並發現,過度表現的vraSR在沒有2% NaCl的狀態下,能造成對扼煞西林感受性增加,研究團隊稱之為類翹翹板效應。因翹翹板效應是不受2% NaCl影響,此突變菌株CGK5mut的一些特徵皆與CGK7相似,而這些特徵即是hVISA所常見的特色,因此研究團隊對CGK5mut的MprF進行反向突變F431L即可使其恢復原有特性,證實這個位點突變的重要性。但CGK6與CGK8雖也有L431F突變卻無此現象,此即表示,它在染色體上又有其他位點的突變,使它恢復生長速度,卻也喪失對萬古黴素降低感受性,但卻又神奇地保留了對扼煞西林感受性增加的翹翹板效應。至於為何突變菌株CGK5mut對扼煞西林感受性增加,其原因為VraSR蛋白表現過多導致PBP2a無法正常地轉置到細胞膜所造成。此研究成果已刊登於微生物學領域期刊Frontiers in Microbiology (2018; 9:1086)。

研究團隊領先發現,在MprF這個蛋白的單一胺基酸突變即足以引起對達托黴素與萬古黴素降低感受性,但增加對扼煞西林的敏感性。由於萬古黴素與達托黴素皆為寶貴的後線抗生素,其抗藥性的產生與治療失敗的發生皆帶給醫療機構極大的震撼,因這意味著患者所能選擇的藥物越來越少,尤其是達托黴素這個新型抗生素,它的上市帶給因萬古黴素治療失敗的個案一線希望。但在這一系列有此突變的菌株中,雖然皆對達托黴素有降低感受性及增加對扼煞西林的敏感性,但也有菌株沒有對萬古黴素降低感受性,此菌株將提供新的基因標的能讓hVISA恢復對萬古黴素的敏感性。此外,對扼煞西林增加敏感性也提供研究團隊新的基因標的以恢復乙內醯胺抗生素對MRSA的效力,預期將可發掘潛在控制金黃色葡萄球菌藥物基因標的。

文/圖:感染症與疫苗研究所陳逢叡副研究員

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