光譜式流式細胞分析儀之應用介紹

流式細胞分析儀(Flow cytometry;亦稱流式細胞儀)技術自1970年代發展至今,其可快速分析單一細胞上的多重特性(如表面抗原表現、細胞內蛋白表現、DNA含量、胞內膜電位變化等)以及能累積大量細胞族群分布特性之獨特效能,而在免疫學、癌症生物學等細胞分析領域占有不可或缺的技術地位。傳統的流式細胞儀採用不同波長的光鏡(optical mirrors)與帶通濾片(bandpass filters),將不同波長之螢光分子散發的螢光訊號分別引導至個別的光學偵測器內,藉此區分不同波段之螢光物質。然而,傳統的濾片式光路設計因無法有效區隔波長相近的螢光分子,且受到預設的濾片規格限制,只能使用特定之螢光種類及組合,使得可同時使用的螢光數與種類相當受限;此外,為了避免相近波長之螢光互相干擾,帶通濾片可偵測的波段也因此受限,僅能偵測部分而無法收集整體之螢光訊號,因此也犧牲了光學偵測的靈敏度。

然而近年來,由於螢光分子合成技術之進展,螢光的種類快速增加;且隨著研究者對於細胞的種類與功能已有更深入地瞭解,如何能夠有效利用有限又珍貴的細胞樣本,分析得到更多的資料,已成為現今學者急欲克服的一道難題。因應此研究趨勢需求,本院核心儀器設施中心於2020年年底增設Cytek Aurora光譜式流式細胞儀(搭配405 nm、488 nm和640 nm三支雷射,共38個螢光偵測器)。創新的光譜式偵測技術(圖1)1是利用多通道粗波分復用(Coarse wavelength division multiplexing, CWDM)技術,先將不同波長之螢光訊號展開,再使用低噪音、高靈敏度的雪崩光電二極體全陣列偵測模組(Avalanche photodiode, APD assays)(圖2),並同時搭配即時分析軟體之光譜拆解(spectral unmixing)技術,可突破傳統流式細胞儀在螢光組合上的限制,有效區分波長相近但光譜特徵(spectrum signature)不同之螢光分子(圖3);不但大幅增加可同時偵測的螢光數,亦可收集完整的螢光訊號,提升螢光偵測的靈敏度。

圖1:傳統濾片式(conventional)偵測與光譜式(Spectral)偵測之比較圖示(Figure adapted from  Nolan and Condello(Curr Proto Cytom, 2013)

圖2:多通道粗波復用(CWDM)技術與APD全陣列模組示意圖

圖3:二個波長相近螢光分子(APC vs. Alexa Fluor 647)之光譜特徵差異示意圖

本院Cytek Aurora光譜式流式細胞儀之配備與特殊應用範例:

  • 使用三支雷射激發,即可同時偵測24種以上之螢光(圖4),進行大規模免疫功能剖析(immune profiling): 適用如腫瘤、COVID-19、肺結核、登革熱等疾病之研究與疫苗研發2、3
  • 單一光學配置規格即可適用所有能被已搭載雷射激發之螢光分子,無須更換光學濾片
  • 有效區分波長相近但光譜特徵不同之螢光分子,如GFP/YFP、PerCP/PerCP-Cy5.5、APC/Alexa647等,可直接利用市面上現有之螢光種類進行組合,無須仰賴廠商客製化抗體
  • 可針對樣本本身之背景自體螢光進行偵測,套用自體螢光扣除(autofluorescence extraction)功能,降低背景值干擾並大幅提升解析度
  • 搭載流量偵測系統(volumetric sensor),無須搭配標準品即可進行絕對細胞計數

圖4:24色免疫功能剖析(immune profiling)圖

Cytek Aurora光譜式流式細胞儀相關資料與預約使用說明請上核心儀器設施中心流式細胞儀核心實驗室網站參閱: http://core.nhri.edu.tw/webcore/webcont!Cont.action?news_id=202103091615277695032&lab_id=cscore

參考文獻:

  1. Nolan JP, Condello D. Curr Protoc Cytom. 2013 Jan;Chapter 1:Unit1.27.
  2. Thompson EA, et al. Cell Rep. 2021 Mar 16;34(11):108863.
  3. Bonilla DL, et al. Front Mol Biosci. 2021 Jan 29;7:612801.

文/圖:核心儀器設施中心流式細胞儀核心實驗室蕭朝陽助技術師

 

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