高通量精準奈米孔單分子基因定序技術

多基因位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)是一種分析病原菌分子流行病學的方法,利用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)針對微生物7至10個管家基因(housekeeping genes)進行增幅,經由核酸定序及序列的比對分析,可得知菌株的品系及親源關係。由於序列型別方便在各地區分析比較不同菌株品系,使其成為研究分子流行病學的重要方法,亦為監控病原微生物爆發的重要工具。然而,傳統使用第一代DNA定序(Sanger定序)耗時且成本昂貴降低了此技術的實際應用,雖然隨著次世代定序(next-generation sequencing, NGS)技術的引入可同時針對多樣品進行高通量的精準定序,著實改善效率及成本問題,但二代定序技術受限其定序長度,不符合長片段的高通量精準多基因位點定序需求。Oxford Nanopore Technologies (ONT)屬於第三代定序技術,可產生較長的序列讀長,但是序列的正確性較低,要進行多基因位點序列分型仍具有相當的難度,因為單一位點的差異即導致不同型別之多基因位點序列;另外,ONT提供的多樣本條碼定序上限為96個樣本,且使用96對引子(primer),程序繁瑣。不過,ONT優點是所使用的定序平台中有MinION定序儀,為可攜式且成本便宜(USD $1,000),所用的定序試劑及晶片價格相當平易近人。

為了解決上述難題,本院感染症與疫苗研究所陳逢叡副研究員與群體健康科學研究所廖玉潔副研究員開發出使用MinION定序的雙條碼(dual-barcode)實驗設計,除了增加DNA條碼的長度使其能正確進行樣品歸屬,亦提升了樣品數容納的規模。首先,利用PCR將有興趣的單一或多重目標基因(target of interest)放大,然後同時將第一層條碼(barcode)加入擴增子(amplicons)的二端。之後利用ONT的非擴增型條碼試劑(native barcoding kit)以接合反應(ligation)的方式將第二層條碼加入第一層條碼之外側。定序完成後利用程式辨識出二層條碼並分類分析下游數據,使其產生全長的多基因資料,並提出nanoMLST(https://github.com/jade-nhri/nanoMLST)的序列分析程序,因此整個技術的操作流程包含了定序資料的轉換、序列品質的篩選、樣品歸類、序列的比對與校正,達成自動化分型,最終證實此技術可針對多樣品進行高通量且精準的多基因位點序列分型。研發結果顯示,單一「MinION晶片」所產出的資料量,以所研發的雙條碼技術分析,足夠同時對一千個以上的樣本進行自動化多基因位點定序,並產出高準確(99.99%)的共通序列(consensus sequence),大幅地降低了定序的成本。

此技術未來可應用於農業、食品安全、公共衛生流行病學、精準醫療(如癌症基因套組(cancer gene panel)檢測)等各方面,其高通量、高準確及長片段定序特性不僅降低經濟成本,自動化分析流程亦省去繁瑣的人力分析時間,亦可開發成各式全自動多基因位點檢測套組。無論是在科研界或產業界都具有其應用性。隨著精準醫療和伴隨式診斷的蓬勃發展,具有巨大的市場潛力,將有持續解決臨床診斷的方案的爆炸性增長機會。此項技術已發表於Microbial Genomics (6(3):e000336),並已技術移轉授權廠商。

 

文/圖:感染症與疫苗研究所陳逢叡副研究員

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